阿基米德粒子檢測系統 Archimedes Particle Metrology System
-------------以不可思議的精度重新定義粒子/細胞質量和分析
美***麻省理工學院(MIT)的世界頂***傳感器大師Scott Manalis教授開創性的微通道諧振器微機電系統（MEMS），***次實現精確測量fg(10-15 g)***粒子的質量，其驚人的測量底限比目前***好的石英微天平方法高出***百萬倍。MEMS技術成為粒子分析的***新黃金標準。
詳細說明
阿基米德為粒子分析設定了***個全新標準，它采用共振質量檢測原理準確定量粒子質量、尺寸、體積、密度和濃度等，其極高的分辨率遠超過了現有的粒子分析方法如動態光散射、激光衍射和布朗運動跟蹤，并***次實現了fg***納米粒子的質量檢測。阿基米德對每個粒子單獨檢測，無需光學部件，檢測樣品與測量信息直接關聯，測量結果更為真實可靠。阿基米德不僅可以用于顆粒的重量和大小，未來該系統還可與HPLC連接作為密度檢測器，可以目前檢測器所不能檢測到的化合物。
阿基米德質量測量底限示意圖:
儀器特點
* 自動檢測粒子大小質量、尺寸、體積、密度及濃度
* 粒子檢測范圍<50 nm-5 μm
* 檢測快速，NIST標定校準
* ***小樣品消耗，低至100 μl
* 極高的分辨率，***性和重現性
原理：共振質量測量
阿基米德對單個粒子及活細胞的質量進行檢測，分辨率低于1飛克 (10-15 g)，遠超過其它流體質量測量方法，核心在于共振微流控通道和共振質量測量，它采用機械共振結構，當粒子或細胞***個個依次通過共振器時，共振頻率因粒子重量而下降。通過檢測共振頻率的改變，***測量每個粒子的質量及大小。
* 共振器采用微電子機械系統制備方法，傳感器僅100 μm大小，總質量僅數ng，如此小巧輕薄的傳感器對即使很小的加載重量也非常靈敏。
* 微通道傳感器被置于真空環境中，傳感器的振動不會消散不必要的能量，從而達到極高的品質因子Q，通常> 10,000，因此共振頻率檢測可達極高的準確度。
* 傳感器中嵌入***個微流通道，全新的應用流體設計可將樣品自動送入傳感器，并精確控制流速，結合極高的Q值，使傳感器更換十分迅速，實現快速測量且結果準確。***些生物樣本如活細胞甚至可以在生理條件下測量。
* 共振頻率測量十分快速且分辨率高，1 kHz 頻寬時可達到十億分之***水平。
阿基米德功能
***、粒子質量和大小檢測
阿基米德檢測單個粒子及活細胞的重量，其核心在于微通道共振器頻率偏移與粒子物理特性間的關系，即物體的浮力重量等同于它排出液體的重量。因此粒子浮力質量可定義為它所替代液體的質量，浮力質量與粒子干重相關，它隨著粒子與流體的密度偏離而增加。當粒子通過微通道時，浮力質量導致共振頻率偏移，當粒子到達共振器頂部時共振偏移達到***大，且與粒子浮重成比例。
阿基米德微通道傳感器靈敏度常數s將共振頻率偏移與粒子浮力質量關聯，對于每個傳感器s數值固定，反映了所測粒子范圍的簡單線性關系。動態光散射只能檢測成千上萬粒子的平均數值，而阿基米德可實現單個粒子測量，大量粒子的共振頻率偏移依次檢測，從而得到單個粒子重量、體積、等效球體直徑等，由此建立準確的粒子群體質量和大小分布。
二、粒子密度檢測
浮力質量導致共振頻率偏移。假如粒子密度比流體密度大，粒子經過傳感器時其總體質量增加，共振頻率下移；假如流體密度比粒子密度大，傳感器整體質量減小，共振頻率上移。***終如果粒子密度與流體密度等同，傳感器質量不變，即浮力重量為零，則不會發生共振偏移。因此，可以應用調節流體密度直到共振頻率偏移消失的方法測量粒子密度。
但上述描述顯然很繁瑣。阿基米德開辟了***個新的更為簡便的方法，只需將樣品分別置于二種不同密度的流體中各檢測***次，得到每個樣品的浮力質量均值。如下圖，多孔硅粒子分別在0.786 g/cc異丙醇和1.106g/cc氘化水中檢測。結果顯示，粒子平均浮力重量在異丙醇中比氘化水大，分別為1.67pg、1.10pg。得到浮力重量數據，阿基米德通過簡單的線性外推法就能自動計算出粒子平均密度。
三、粒子濃度及內含物檢測
阿基米德以***真實的計數方法對每個粒子單獨檢測，通過流控技術精確監控整個測量過程中樣品流速，可提供信息包括粒子濃度 [#/ml]、樣品消耗 [μl]、固形物含量 [parts per billion]。這些信息可廣泛應用于
* 監測蛋白制劑中聚集物含量
* 監測細菌生長及抗生素易感性
* 檢測藻類及其它生物燃料中的生物量
* 評估油墨中阻塞打印頭的附聚物
四、極微小差異粒子區分
阿基米德可以極好的區分不同粒子質量或大小的極微小差異，下左圖顯示二種粒子大小僅差40nm，阿基米德對粒子群體也能準確區分，且標準方差不到標準參數的***半，標準誤差達到單個?水平。右圖顯示三種形態分布的黃金粒子，標定為 57 nm、79 nm、100 nm，阿基米德檢測結果為57 nm、81 nm、99 nm。DLS方法檢測卻無法分辨此三種粒子，所測粒子大小也明顯有誤。
五、混合粒子分析
阿基米德***性可達NIST 1%水平。以下四種不同標定的標準品混合物，阿基米德可單獨分析每個亞群，得出粒子平均大小與標準參數相差僅0.1%-0.5%。此外在不同批次的傳感器和儀器之間也能體現極好的重現性。
阿基米德應用
***、蛋白制劑檢測
蛋白療法可以緩解多種人類疾病，也可以替代非內源產生的關鍵蛋白，蛋白制劑在蛋白治療中起著關鍵的運輸作用，但是蛋白聚集會降低其療效，因此十分有必要監測它在研發、生產、存儲及運輸治療蛋白或其它生物藥劑過程中的聚集情況。
粒子聚集
阿基米德可以準確測量粒子聚集，大小低至100nm。它不再受光學或形狀變化及阻礙光學方法的乳白光的影響。其柔和的流體控制不會擾亂微弱聚集，且可適應粘度達50cP而無需稀釋。阿基米德傳感器非常小，皮升***體積，僅需樣本100 μl，可承受聚集濃度達5x108/ml，對于高濃度制劑無需稀釋。聚集測量通過單個粒子的檢測直接測得濃度。下圖顯示4 μl 原始樣品中亞微米IgG蛋白聚集物的大小分布，所測濃度 >300 nm粒子聚集物是 4x106/ml（左圖）。基于檢測數目龐大，其分布可以計算為組成每個聚集物的基礎蛋白數量。
外源物區分
阿基米德也能將外源物質從蛋白聚集物中區分。如下圖，向下的峰由聚集引起，其密度高于懸液密度。另外可見***些向上的峰，由硅油滴引起，密度小于懸液，它們的存在減小了傳感器的總質量，使共振頻率增加。基于這些顯著差異阿基米德可以準確區分聚集物與油滴，并可作出每個群體粒子大小分布。
總而言之，阿基米德可以定量分析蛋白制劑中顯微可見物甚至亞微米物質，它為早期聚集過程中制劑質量和外源物含量提供了很有價值的反饋信息，且相對光學方法能提供更多的信息。
二、微生物/細胞檢測
阿基米德柔和的樣品流動,確保可以在生理狀態下,提供前所未有的活細胞檢測,檢測結果要遠遠超越庫爾特技術和流式細胞技術,獲得***精確的細胞質量分布,監測細菌生長,以及在***寬廣的動力學范圍內進行全血檢測.
整個細菌高分辨率的體外檢測在微生物學應用方面有重要意義，包括研究細菌生命周期以及對環境的反應，細菌作為模式生物探討分子進程和信號通路，傳染病中抗體發現和抵抗力研究。目前常規光密度法能檢測整個培養體系濃度，但無法測量單個細菌及其物理性能，庫爾特計數器的體積限度無法滿足個體小的細菌檢測。
阿基米德是***個可用于單個細菌物理性能測量的儀器，且分辨率極高，同時也能定量評估整個培養系統。阿基米德亞飛克***的質量分辨率比普通細菌質量的1%還小，它能實時跟蹤細菌生長變化過程，監測其生長速率、質量和大小分布，不同階段的過渡如指數增長和平穩期，對環境因素如溫度、營養、抗菌劑的反應。此外，阿基米德還能結合高放大率視頻直接觀察細菌形態和集體行為。它可廣泛應用于分子通路模型研究、抗菌藥物研發、藥敏測試等。
細菌質量檢測
下圖顯示了大腸桿菌ATCC 25922檢測結果。每個向下峰即代表單個細菌通過微通道傳感器，并引發共振頻率降低。直方圖顯示浮力質量和大小的分布，均值分別近250fg和1.8μm。除質量檢測外，阿基米德還整合了高放大率的視頻來揭示單個細菌進入傳感器入口時的情形。
細菌生長檢測
阿基米德可實時監測微生物群生長變化，包括質量增長和聚集運動等。下圖顯示E. coli 25922從穩定期至生長期的監測。紅點表示每個細菌的浮力重量和相應的檢測時間。直方圖顯示培養液細菌質量分布及培養成熟度，初始培養45min后，細菌質量分布寬泛，顯示凝集跡象，這很可能源于curli菌毛的生成和蛋白附屬物介導的細菌的粘附。凝集歷經65min后轉變成生長階段，此時 E. coli 大多鞭毛驅動運動進行有絲分裂約20min，質量分布變窄，集中在230fg。
M. Godin等應用阿基米德原理，在***個比細胞自身生長周期更短的時間內捕獲細胞，分別檢測4種不同的細胞系瞬間生長速率，對于每個捕獲事件，其生長速率取決于捕獲開始時的細胞浮力質量。結果表明，越重的細胞相對質量輕的生長越快。
Using Buoyant Mass to Measure the Growth of Single Cells,M. Godin etc., NATURE METHODS, (2010)
細菌對環境的反應
營養成分影響
已處于生長階段的少量E. Coli 加入新鮮Luria培養基。E. Coli 快速經歷細胞周期，三小時內其平均濃度顯著增加，呈指數增長。細菌內部參數表現穩定，包括平均體積、密度和細胞分子組成等。
A.K. Bryan等研究了酵母細胞在不同試劑處理后各生長周期不同階段細胞密度、體積和質量的變化。數據分析表明細胞密度和生長速率是與其生長周期協調***致的。
Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast, A.K. Bryan etc., PNAS, 2010
抗體影響
初始培養約2.75小時后，加入100 μg/ml氨芐青霉素，約為達到抑制生長***小量的10倍。4min重取樣間隔時間內，細菌數量停止增長，抗生素效應在極短時間內得以評估。此外，細菌總數開始下降，40min后群體完全消失。由于氨芐青霉素干擾細胞壁生長有殺菌性，細菌很快破碎。這在上面直方圖中有體現，可以看到大量低質量碎片。共振質量測量也曾用于檢測抗生素抗性，基于它們對滲透休克的反應。
溫度影響
E. coliK12分別生長于20℃與36℃，虛線代表不同溫度下細菌生長狀況。
三、顏料和墨水檢測
顏料的理化性質對于其在終產品中的性能尤為關鍵，如油漆、化妝品、噴墨油墨。目前
激光衍射廣泛用于評估顏料特性。但是顏料對應波長不同的吸光值以及形狀和大小的影響，使其折射率很難精確定量，因此光散射結果存在不確定性。此外需要將初始顏料粒子從可形成不穩定分散液的聚集物中區分開來，***般儀器很難做到，且基于光學的儀器都無法檢測不透明產物狀態的顏料，如油漆和油墨。
阿基米德則擅長測量顏料，它不受任何光學特性變化的影響，對每個顏料粒子直接檢測，包括質量或者等效球體的直徑，并能輕易區分原始顏料和聚集物，同樣也能評估顏料在油墨、油漆或化妝品中分散的穩定性。
顏料粒子檢測
如下圖，分析了軍用***別的顏料和添加劑，包括樣品群體的質量、等效球體直徑、標準差及其它統計數據，結果突出顯示了平均直徑與D10/D90。
顏料懸液檢測
阿基米德浮力質量也能用于檢測顏料或添加劑懸液。下圖顯示了相同的LaMnO4樣品分散于異丙醇的頻移時間圖，它記錄了因LaMnO4粒子比溶液密度大(5.5 vs 0.8 g/cc)而產生的向下峰以及液滴輕于異丙醇而產生的向上峰，其中12%為正浮力液滴，它可能源于表面活性物質或者陷于顏料混合物中的空氣在液滴懸浮時的釋放。群體監測結果顯示它在約1小時內分散并消失。相比之下，氧化鋯和氧化鎳樣品則不含如此多低密度的氣泡或液滴。
墨水檢測
同***類型墨水分別準備4份，乙酸乙酯1000：1稀釋，檢測表明粒子大小***致約130nm。對未稀釋的原樣進行檢測，由于濃度太高 (> 1011/ml) 導致無法進行單個粒子檢測，因此設定檢測>1 μm粒子，觀察由懸液中不穩定聚集及引發的結絮。結果顯示更大量聚集樣品中粒子濃度數量有顯著差異。更大聚集量樣品濃度與更長的保質期相關，也與樣品造成噴墨噴嘴堵塞問題相關。
滬公網安備31011502016460號
