SABiosciences第二代功能分類基因芯片
價(jià) 格：詢價(jià)
產(chǎn) 地：美國(guó)更新時(shí)間：2020-10-27 13:33
品 牌：SABiosciences型 號(hào)：
狀 態(tài)：正常點(diǎn)擊量：1312
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SABiosciences公司新近推出了第二代功能分類基因芯片。該芯片基于SABiosciences公司開發(fā)的200多種 Oligo基因芯片（第***代功能分類基因芯片），結(jié)合了實(shí)時(shí)定量PCR和第***代功能分類基因芯片的優(yōu)點(diǎn)，可在***次實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)確定量檢測(cè)上百個(gè)基因的mRNA水平。
SABiosciences公司在第二代功能分類基因芯片的研發(fā)過(guò)程中，攻克了從反應(yīng)體系優(yōu)化到基因準(zhǔn)確定量等多方面的技術(shù)難點(diǎn)。該芯片不僅克服了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)工作量大、耗時(shí)久的缺點(diǎn)，而且將基因芯片的檢測(cè)精度提高到了與實(shí)時(shí)定量PCR相當(dāng)?shù)乃健?/p>
1、引物設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)
SYBR Green可與所有的雙鏈DNA反應(yīng)（包括引物二聚體），為了使擴(kuò)增反應(yīng)集中于目的基因，避免非特異性擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)成為關(guān)鍵因素。為得到單***特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，避免擴(kuò)增出序列相似的非特異性產(chǎn)物，采用BLAST或者其他比對(duì)方法，檢測(cè)引物在相應(yīng)物種（如人，小鼠或大鼠）全基因組中的特異性。為了保證在相同的PCR條件下（特別是統(tǒng)***的退火溫度），不同基因均能擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性產(chǎn)物，對(duì)引物的CG值，解鏈溫度（Tm），以及其他化學(xué)和物理的特性都進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整。為了獲得高擴(kuò)增效率，對(duì)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度也進(jìn)行了優(yōu)化，***般為100到200bp，確保在統(tǒng)***的循環(huán)反應(yīng)的時(shí)間范圍內(nèi)，不同基因均能擴(kuò)增出完整片段。
2、反應(yīng)體系優(yōu)化
為避免非特異性擴(kuò)增，使用化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)Taq酶，只有經(jīng)過(guò)熱激步驟，Taq酶才能發(fā)揮擴(kuò)增活性。同時(shí)，反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可***大限度減少引物二聚體形成，并且保證較難擴(kuò)增的片段都得到極高的擴(kuò)增效率。
3、定量結(jié)果可靠
在標(biāo)準(zhǔn)的96孔PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，為了獲得高通量，無(wú)法為每個(gè)樣品單獨(dú)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。在完全相同的PCR反應(yīng)條件下，希望表達(dá)量不同的多個(gè)基因均獲得可靠的結(jié)果，需要確保每個(gè)基因都有較高的擴(kuò)增效率，從而可采用簡(jiǎn)單的△△Ct方法計(jì)算基因表達(dá)量。
SABiosciences第二代功能分類基因芯片
第二代功能分類基因芯片與第***代功能分類基因芯片共同之處在于，對(duì)基因按照信號(hào)通路或者功能進(jìn)行有目的的分類和篩選，避免了高通量基因芯片因數(shù)據(jù)過(guò)多而難以分析的缺點(diǎn)，數(shù)據(jù)分析直接高效。而相較第***代功能分類基因芯片，第二代功能分類基因芯片還具有以下的優(yōu)越性：使用芯片即可達(dá)到實(shí)時(shí)定量PCR的精度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)須再進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。
靈敏度高 擴(kuò)增效率好——總RNA量***低可至0.5ng，擴(kuò)增效率達(dá)到*** |
圖1：模板為人總RNA（GA-004）的10倍梯度稀釋樣品，采用人炎癥細(xì)胞因子和受體芯片（APH-011A），分別檢測(cè)看***基因和炎癥特異性基因的表達(dá)。以Ct值為縱坐標(biāo)和RNA樣品量為橫坐標(biāo)作圖。樣品量***少為0.5ng，線性范圍達(dá)到105（0.5ng到5ug）。斜率均值為-3.26±0.41，說(shuō)明擴(kuò)增效率達(dá)到約*** |
圖2：正常乳腺組織和乳腺癌的總RNA（BioChain Institute，Inc.，5.0ug）反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。采用人癌癥信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)者芯片（APH-033A），實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。不同樣品線性范圍均可達(dá)到105；在不同的樣品稀釋度下，同***看***基因的相對(duì)表達(dá)量均相同。 |
重復(fù)性好 誤差范圍小——在低Ct值下，重復(fù)性好 |
圖3：為檢測(cè)芯片重復(fù)性，對(duì)兩種不同樣品分別進(jìn)行3次重復(fù)，共6次實(shí)驗(yàn)。A顯示89個(gè)基因（包括84個(gè)通路特異性基因和5個(gè)看***基因）Ct值的均值，并且每個(gè)點(diǎn)上均標(biāo)明相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差。可見(jiàn)Ct值低時(shí)，重復(fù)性好（誤差范圍小），Ct值高，重復(fù)性較差（誤差范圍較大），與實(shí)時(shí)定量PCR的預(yù)期結(jié)果***致。B說(shuō)明，Ct值標(biāo)準(zhǔn)差均值約為0.25個(gè)循環(huán)。因此，對(duì)于大多數(shù)基因（Ct值小于30），超過(guò)2倍的表達(dá)差異（顯著性差異）可以準(zhǔn)確測(cè)出。C通過(guò)Ct值的CV值檢測(cè)重復(fù)性。同樣，CV值低表明重復(fù)性好。 |
特異性高——產(chǎn)物特異性高，可區(qū)分同***樣品中的同源基因 |
圖4：為檢測(cè)第二代功能基因芯片的特異性，單獨(dú)測(cè)定每個(gè)基因的熔解曲線，隨后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，熔解曲線和凝膠電泳結(jié)果***致，熔解曲線均只出現(xiàn)***個(gè)峰，電泳圖中只有單***條帶，條帶大小與預(yù)期結(jié)果***致。因此，芯片檢測(cè)結(jié)果特異性高，可以區(qū)別RNA樣品中同***基因***族的同源基因。 |
綜上所述，第二代功能分類基因芯片，由于其靈敏度高，樣品的使用量低，每張芯片使用的總RNA***少可為0.5ng；可觀察到的動(dòng)態(tài)線性范圍超過(guò)105，可以同時(shí)檢測(cè)表達(dá)量差異較大的基因；Ct值的平均差異只有0.25個(gè)循環(huán)，可檢測(cè)超過(guò)兩倍的基因表達(dá)量變化。因此，第二代功能分類基因芯片是研究特定信號(hào)通路或者***組功能相關(guān)基因表達(dá)量的理想方法。
滬公網(wǎng)安備31011502016460號(hào)
